Студопедия
Случайная страница | ТОМ-1 | ТОМ-2 | ТОМ-3
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

Получение клонотек генов

Читайте также:
  1. Damage, Destruction, and Remove from Game / Получение повреждения, уничтожение и удаление из игры
  2. III стадия. Получение HNO3.
  3. V. Отчетность по выдаче талонов на получение ЛПП и контроль
  4. Анкета претендента на получение Губернаторской стипендии в I семестре 2014 -2015 учебного года за особые успехи в творческой деятельности.
  5. Аудиторская проверка должна проводиться таким образом, чтобы результатом ее стало получение объективной и полной информации о деятельности общества.
  6. Встреча с Адзомом Другпа и получение учения
  7. Выделение бактериофагов из окружающей среды, получение фаголизата, обнаружение (индикация) бактериофагов

Клонотека генов представляет собой набор разных последовательностей нуклеотидов ДНК, клонированных в составе векторных молекул, которые в сумме составляют весь геном исследуемого организма или какую-либо известную его часть. При этом репрезентативная клонотека должна заключать в себе с высокой долей вероятности любую последовательность нуклеотидов изучаемого генома. Как уже подробно обсуждалось выше, для большинства генов эукариот характерна интрон-экзонная структура, а интроны, присутствующие в первичных транскриптах таких генов, вырезаются в процессе сплайсинга с образованием зрелых молекул мРНК. Для получения экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот, а также изучения тканеспецифической экспрессии генов возникает необходимость в получении кодирующих последовательностей эукариотических генов без интронов. В этом случае задача решается через создание репрезентативных клонотек кДНК, в которых с высокой вероятностью представлены последовательности нуклеотидов мРНК, синтезирующихся в тканях, культурах тканей или отдельных соматических клетках.

На рис. II.8 представлена схема конструирования клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора. Следует иметь в виду, что общие принципы получения клонотек генов приложимы и к любым другим векторам. На первом этапе конструирования осуществляют подготовку вектора и клонируемой ДНК. Космидный вектор расщепляют рестриктазами BamH I и Sma I, причем рестриктаза Sma I расщепляет ДНК с образованием "тупых" концов. В результате образуются два "плеча" космидного вектора, содержащих область начала репликации ori, используемую системой репликации бактериальных клеток, и два селектируемых маркера, которые представляют собой гены устойчивости к антибиотикам – ампициллину (Ampr) и канамицину (Kanr), а также два cos -сайта хромосомы бактериофага l. Параллельно со всеми необходимыми предосторожностями получают препараты высокомолекулярной ДНК, которую необходимо клонировать.

Геномную ДНК подвергают частичному гидролизу мелкощепящей рестриктазой Mbo I (узнает последовательность из четырех нуклеотидов GATC, которые комплементарны "липким" концам, образуемым рестриктазой BamH I). Время рестрикции и концентрацию фермента подбирают таким образом, чтобы средняя длина образующихся фрагментов ДНК составляла 35–45 т.п.о. Обогащенную фракцию фрагментов ДНК подобного размера далее получают центрифугированием смеси рестрикционных фрагментов в градиенте концентрации сахарозы и лигируют с приготовленными "плечами" вектора в условиях, при которых образование сшивок по "тупым" концам минимально. При этом, помимо требуемых молекул рекомбинантных ДНК, могут образовываться и артефактные молекулы, которые не будут упаковываться в фаговые частицы либо из-за их неоптимального размера, либо вследствие неправильной ориентации cos -сайтов.

Полученную после лигирования сложную смесь молекул рекомбинантных ДНК упаковывают в фаговые частицы стандартным способом, и образовавшимися фаговыми частицами заражают подходящие бактериальные клетки. В итоге колонии бактериальных клеток, которые выросли в присутствии антибиотиков, должны заключать в себе различные последовательности нуклеотидов клонируемой ДНК приблизительно одинаковой длины.

На этом частном примере был рассмотрен один из подходов к конструированию клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора, который иллюстрирует все основные этапы получения клонотек генов с применением и других векторов, плазмидных или фаговых. Во всех случаях для получения репрезентативных клонотек генов следует помнить о необходимости случайной фрагментации клонируемой высокомолекулярной ДНК, с тем чтобы все участки генома в образующейся смеси фрагментов были представлены равновероятно. Кроме того, размеры образуемых фрагментов ДНК должны соответствовать емкости вектора, используемого для их клонирования. Так, для клонирования в космидах необходимо получать фрагменты ДНК длиной 35–45 т.п.о., тогда как для клонирования в фаговых векторах типа Charon и плазмидах эти размеры должны составлять соответственно 20–24 и 1,5–3,0 т.п.о.

Чем короче фрагменты, используемые для получения библиотек генов, и чем сложнее исследуемый геном, тем большее число клонов необходимо получить, чтобы клонотека была полной. Например, для того чтобы создать геномную клонотеку бактерий из фрагментов ДНК длиной в 20 т.п.о., в которой любая последовательность была бы представлена с вероятностью 99%, в ней необходимо иметь 460 клонов, тогда как для млекопитающих это число возрастает до 600000, а для покрытосеменных растений оно еще в ~10 раз больше. Отсюда следует, что в случае получения репрезентативных клонотек генов бактерий для решения такой задачи вполне достаточно плазмидных векторов, несмотря на их небольшую емкость. В то же время использование плазмид для создания полных клонотек генов млекопитающих или растений совершенно бесперспективно, так как потребовало бы поддержания в клонотеке огромного количества клонов, многие из которых с большой вероятностью могут быть утрачены.

Выше были обсуждены условия, которые необходимо соблюдать для получения репрезентативных клонотек геномной ДНК. Однако во многих случаях не возникает необходимости работать с полными клонотеками генов, и исследователи ограничиваются неполными клонотеками, обогащенными отдельными участками генома. Так, клонотеки кДНК заключают в себе последовательности нуклеотидов, которые в виде зрелых мРНК специфически экспрессируются в различных клетках или тканях. То же можно сказать и о клонотеках повторяющихся последовательностей нуклеотидов, отобранных из препарата суммарной ДНК на основании кинетики их реассоциации.


Дата добавления: 2015-08-18; просмотров: 100 | Нарушение авторских прав


Читайте в этой же книге: Эффективность расщепления коротких последовательностей ДНК некоторыми распространенными рестриктазами | ДНК- и РНК-лигазы | Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК | Другие ферменты | Плазмидные векторы | Векторы на основе фага l | Космиды и фазмиды | Сверхъемкие векторы YAC, BAC и PAC | Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы | Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование |
<== предыдущая страница | следующая страница ==>
Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений| Введение рекомбинантных ДНК в клетки

mybiblioteka.su - 2015-2024 год. (0.005 сек.)