Студопедия
Случайная страница | ТОМ-1 | ТОМ-2 | ТОМ-3
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатика
ИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханика
ОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторика
СоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансы
ХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника

Досягнення генетичної інженерії

Читайте также:
  1. Досягнення та втрати української культури в 1920- ті, 1930 – ті рр.
  2. ЗАВДАННЯ ДЛЯ ПЕРЕВІРКИ ДОСЯГНЕННЯ КОНКРЕТНИХ ЦІЛЕЙ НАВЧАННЯ
  3. ШЛЯХИ ДОСЯГНЕННЯ МЕТИ
  4. Що ми повинні зробити для досягнення цілей іншої команди?

Практичні досягнення біотехнології.

У молекулярній біології використання біотехнологічних методів дозволяє визначити структуру геному, зрозуміти механізм експресії генів, змоделювати клітинні мембрани для вивчення своїх функцій тощо.

Конструювання потрібних генів методами генної та клітинної інженерії дозволяє управляти спадковістю і життєдіяльністю тварин, рослин i мікроорганізмів і створювати організми з новими корисними в людини властивостями, раніше які не спостерігались у природі.

Мікробіологічна промисловість у наш час використовує тисячі штамів різних мікроорганізмів. Найчастіше вони поліпшено шляхом індукованого мутагенезу і наступної селекції. Це дозволяє вести широкомасштабний синтез різних речовин.

Деякі білки, й вторинні метаболіти можна отримати лише шляхом культивування клітин еукаріот. Рослинні клітини можуть бути джерелом низки сполук - атропін, нікотин, алкалоїди,сапонини та інших.

У біохімії, мікробіології, цитології безсумнівний інтерес викликають методи іммобілізації як ферментів, і цілих клітин мікроорганізмів, рослин та тварин.

У ветеринарії широко використовуються такі біотехнологічні методи, як культура клітин та зародків,овогенез in vitro, штучне запліднення.

Усе свідчить тому, що біотехнологія стане джерелом як нових продуктів харчування медичних препаратів, так й отримання енергії і нових хімічних речовин, і навіть організмів із наперед заданими властивостями.

Перспективи розвитку біотехнології

Центральна проблема біотехнології – інтенсифікація биопроцессов за рахунок зростання потенціалу біологічних агентів та його систем, і завдяки вдосконаленню устаткування, застосування біокаталізаторів (іммобілізованих ферментів і клітин) у промисловості, аналітичної хімії, медицині.

У основі промислового використання досягнень біології лежить техніка створення рекомбінантних молекул ДНК.

Конструювання потрібних генів дозволяє управляти спадковістю і життєдіяльністю тварин, рослин i мікроорганізмів і створювати організми з новими властивостями.

Досягнення генетичної інженерії

Ген гормону росту людини довжиною 584п.н.— найбільш довгий з штучно синтезованих нині. Він був вмонтований в плазміду,реплицирующуюся в Є.coli під медичним наглядом промотора триптофанового оперона.

Трансформовані отриманої химерноюплазмидой клітини Є.coliпродуцировали при індукціїпромотора близько 3 млн. молекул гормону зростання людини у розрахунку клітину. Цей полипептид, як було встановлено в експериментах на пацюках з віддаленим гіпофізом, виконуваних функцій виявився повністю ідентичний гормону росту людини.

Ще одна найважливіший етап - це синтез біополімерів по встановленої структурі. Перші комерційні прилади, що виробляють автоматизований синтезполипептидов, розробили з урахуванням досліджень Меррифилда в1963г. Їх використовують у дослідницьки хлабораториях й у фармацевтичної промисловості.

Метод хімічного синтезу генів забезпечив також можливістю отримання штамів бактерій продуцентів інсуліну людини, важливого лікувального препарату для діабетиків.

«Ген інсуліну синтезували з більш сорока переважно шестичленних олігонуклеотидів, які потім об'єднували на єдину структуру з допомогоюДНК-лигази. Отримані двох ланцюгові полинуклеотиди довжиною 271 і 286 пар підстав були вмонтовані вплазмидние вектори. Туди ж були вмонтовані і регуляторні ділянки ДНК, щоб забезпечити експресію гібридних молекул. Клонированние гени кодували синтез проінсуліну, який шляхом нескладної хімічної обробки можна перетворити на активний інсулін, до складу якого двіп олипептидние ланцюга. Проте й У з 21 і 30 амінокислотних залишків, з'єднаних між собоюсульфгидрильними зв'язками».

У такий спосіб отримані і клоновані гени, які кодують глобини людини, тварин і птахів, білок кришталика очі бика, яєчний білок, фібрин шовку, продукований шовковицевим шовкопрядом, та інших.

Той самий принцип застосований щоб одержати, клонування й експресією генів інтерферону людини у бактерії. Інтерферон - цінний лікарський препарат, широко використовуваний для боротьби з на вірусні інфекції і лікування інших захворювань, включаючи злоякісні пухлини. Інтерферон виробляється у клітинах тварин і людини, але має вираженої видовий специфічністю.

Ю. А. Овчинников і У. Р.Дебабов з працівниками отримали мікроорганізми, ефективносинтезирующие інтерферони людини. Цим дослідникам вдалося сконструювати рекомбинантні плазмідами, які обумовлюють синтез інтерферону людини у Є.coli.

Очищений з клітин бактерій інтерферон за своїми фізико-хімічним і біологічним властивостями виявився близький інтерферону, що у крові донорів.

У лабораторіях світу набирає обертів розшифровка геному людини. Ця міжнародна програма була започаткована 1989 року.

Нині у різних країн світу, в лабораторіях, що поділили між собою «фронт робіт» (всього треба прочитати близько три мільярди пар нуклеотидів), щодня розшифровується понад мільйон нуклеотидних пар, причому темп робіт пришвидшується.

Якщо в дріжджів функція половини генів у геномі невідома (званімолчащие гени), те в хробака З. elegans ця частка ще більше: з 19 тисяч генів 12 тисяч залишаються тут поки загадковими.

Значення секвенування геному нематоди, звісно, виходить далеко далеко за межі те, що може бути полігоном для розшифровки геному людини. З. elegans - перший багатоклітинний організм, геном якого розкрито практично цілком.

Можна нагадати: кілька років тому був розшифровано перший геномеукариотического організму - дріжджів, тобто організму, клітини якого містять оформлені ядра.

Інакше висловлюючись, два роки пройдено шлях від геному одноклітинного до геному багатоклітинного організму.

Програма «Геном людини», як говорилося, - програма загальнолюдська. Кожна лабораторія, у якій країні, вона була, вносить у ній посильний внесок. І щойно комусь вдається розкрити структуру нового гена, цю інформацію негайно вступає у Міжнародний банк даних, доступний кожному досліднику.

Зараз, навіть важко передбачити всі можливості, які буде реалізовано у найближчі кілька десятиліть.

 

У медицині біотехнологічні прийоми і методи грають головну роль при створенні нових біологічно активних речовин і лікарських препаратів, призначених для ранньої діагностики і лікування різноманітних захворювань. Антибіотики — найбільший клас фармацевтичних сполук, які одержуються мікробіологічним синтезом. Створено генно-інженерні штами кишкової палички, дріжджів, що культивуються клітин ссавців та комах, використовувані для одержання гормону росту, інсуліну й інтерферону людини, різноманітних ферментів і противірусних вакцин. Змінюючи нуклеотидну послідовність у генах, що кодують відповідні білки, оптимізують структуру ферментів, гормонів і антигенів (так звана білкова інженерія). Найважливішим відкриттям стала розроблена 1975 Р. Келером і С. Мільштейном техніка використання гібридів для одержання моноклональних антитіл бажаної специфічності. Моноклональні антитіла використовують як унікальні реагенти, для діагностики і лікування різноманітних захворювань.

Біотехнологія й медицина

Нет такого експериментального підходу чи дослідницького напрями у біотехнології, які не отримали застосування до медицини. Саме тому настільки різноманітні зв'язок між біотехнологією і найбільш гуманної із усіх наук. Тут ми зупинімося лише на основних моментах.

Антибиотики.

Антибиотики — це специфічні продукти життєдіяльності, які мають високої фізіологічної активністю стосовно певним групам мікроорганізмів і до злоякісним пухлин, вибірково затримуючих їх зріст чи повністю придушуючих розвиток. Не всі з цих сполук, кількість яких наближається до 5000, допущені для застосування до медицини. Мутасинтез. Застосовують мутантні штами, які мають блокований синтез окремих фрагментів молекули антибіотика. У четвер культивування вносять аналоги цих фрагментів. Мікроорганізм використовує ці аналоги для біосинтезу, у результаті отримують модифікований антибіотик. 4. Клітинна інженерія. Отримують гібридні антибіотики, наприклад, з новими комбінаціями агликона і Сахаров. 5. Генетична інженерія — введення у геном мікроорганізму інформації про фермент, необхідному для модифікації продуцируемого антибіотика, наприклад його метилування з допомогою метилаз. Багатообіцяючим підходом служить инкапсулирование антибіотиків, зокрема включення в лигюсомы, що дозволяє прицільно доставляти препарат лише до визначених органам і тканинам, підвищило б його ефективність яких і знижує побічна дія. Такий підхід прийнятний і й інших лікарських препаратів. Наприклад, кала-азар, хвороба, викликане лейгшма-нией, піддається лікуванню препаратами сурми. Проте лікувальна доза цих препаратів токсична в людини. У складі ліпосом препарати сурми вибірково доставляються до органів, ураженим лейшманией, — селезінці й цирози печінки. Замість антибіотика у організм дозволить вводитися його продуцент, антагоніст збудника захворювання.

 

Гормоны.

Биотехнология надає медицині нових шляхів отримання цінних гормональних препаратів. Особливо великі зрушення припадають на останні роки у бік синтезу пеп-тидных гормонів. Раніше гормони одержували доходи з органів прокуратури та тканин тварин і людини (крові донорів, віддалених під час операції органів, трупного матеріалу). Треба було багато матеріалу щоб одержати невеликої кількості продукту. Так, людський гормон зростання (соматотропін) одержували доходи з гіпофізу людини, кожен гіпофіз містить їх більше чотирьох мг. У той самий час на лікування одного дитини, котрий страждає карликовостью, потрібно близько сьомої години мг соматотропіну в тиждень; курс лікування має тривати кілька років. З застосуванням генноинже-нерного штами Є. coli нині отримують до 100 мг гормону зростання на 1 л середовища культивування. Відкриваються перспективи боротьби лише з карликовостью, але й низкорос-лостью — слабшої ступенем дефіциту соматотропіну. Соматотропін сприяє загоєнню ран і опіків, поруч із каль-цитонином (гормоном щитовидної залози) регулює обмін Са2+ в кістковій тканині. Інсулін, пептидный гормон острівців Лангерганса підшлункової залози, представляє основне засіб лікування при цукровому діабеті. Ця хвороба викликана дефіцитом інсуліну і виявляється підвищенням рівня глюкози у крові. Донедавна інсулін одержували доходи з підшлункової залози бика, і свині. Препарат відрізнявся від людського інсуліну 1—3 аминокислотными замінами, отже виникала загроза алергічних реакцій, особливо в дітей. Широкомасштабне терапевтичне застосування інсуліну стримувалося його високої вартістю і обмеженістю ресурсів. Шляхом хімічної модифікації інсулін з тварин вдалося зробити неотличимым від людського, але ці означало додаткове подорожчання продукту. Компанія Eli Lilly з 1982 р. виробляє генно-інженерний інсулін з урахуванням роздільного синтезу Є. coli його А- і В-цепей. Вартість продукту значно знизилася, отримуваний інсулін ідентичний людському. З 1980 р. у пресі є повідомлення про клонуванні у Є. сой гена проінсуліну — попередника гормону, переходить у зрілу форму при обмеженому протеолизе. До лікування діабету прикладена також технологія инкапсули-рования: клітини підшлункової залози в капсулі, запроваджені одноразово у організм хворого, продукують інсулін протягом року. Компанія Integrated Genetics розпочала випуск фолли-кулостимулирующего і лютенизирующего гормонів. Ці пептиди складено з цих двох субодиниць. На порядку денному питання промисловому синтезі олигопептидных гормонів нервової системи — энкефалинов, побудованих з 5 амінокислотних залишків, і ендорфінів, аналогів морфіну. При раціональному застосуванні ці пептиди знімають больові відчуття, створюють хороше настрій, підвищують працездатність, концентрують свою увагу, покращують пам'ять, доводять до ладу режим сну й неспання. Прикладом успішного застосування методів генетичної інженерії може бути синтез р-эндорфина за технологією гібридних білків, описаної вище іншому пептидного гормону, соматостатину. Значним є внесок біотехнології й у промислового виробництва непептидных гормонів, насамперед стероїдів. Методи мікробіологічної трансформації дозволили різко скоротити кількість етапів хімічного синтезу кортизону, гормону надниркових залоз, застосовуваного на лікування ревматоїдного артриту. За виробництва стероидных гормонів широко використовують іммобілізовані мікробні клітини, наприклад Arthrobacter globiformis, для синтезу преднізолону з гидрокортизона. Є розробки з отриманню гормону щитовидної залози тироксину з микроводорослей.

Інтерферони, интерлейкины, чинники крови.

Интерфероны виділяються клітинами людини і тварин у відповідь инфици- рование вірусами. Вони мають антивірусної активністю. Механізм дії інтерферонів остаточно не з'ясований. Передбачається, зокрема, що Інтерферони перешкоджають проникненню вірусних частинок у клітину. Інтерферони стимулюють діяльність імунної системи та перешкоджають розмноженню клітин ракових пухлин. Усі аспекти дії інтерферонів важливі з погляду їх терапевтичного застосування. Розрізняють?-,?-,?- і (-інтерферони, утворювані відповідно лейкоцитами, фибробластами сполучної тканини, Т-лимфоцитами і эпителиальными клітинами. Найбільше значення мають перші групи. Інтерферони складаються з 146—166 амінокислотних залишків,? - і?-інтерферони пов'язані із залишками Сахаров (гликозилированы). До запровадження методів генетичної інженерії інтерферони одержували доходи з донорської крові — до 1 мкг неочищеного інтерферону з 1 л крові, т. е. приблизно одну дозу для ін'єкції. Нині?-,?- і?-інтерферони успішно одержують з застосуванням генноинженерных штамів Є. coli, дріжджів, культивованих клітин комах (Drosophil?) і ссавців. Генно-інженерні інтерферони може бути очищені з допомогою моноклональних антитіл. У будь-якому випадку- і р- інтерферонів переважно застосування эукариотических продуцентів, так як прокаріоти не гликозилируют білки. Деякі фірми, наприклад Bioferon (ФРН), використовують не генно-інженерні мутанти, а культивовані in vitro фибропласты людини. Інтерферони йдуть на лікування хвороб, що викликаються вірусами герпесу, сказу, гепатитів, цитомегаловиру-сом, вірусом, що викликають небезпечне поразка серця, і навіть для профілактики вірусних інфекцій. Вдихання аерозолю інтерферонів дозволяє попередити розвиток гострих респіраторних захворювань. Кілька курйозною проблемою є те інтерферони, в частковості?-інтерферони, самі можуть викликати в пацієнтів простудні симптоми (нежить, підвищення тощо.). Проблема побічного дії дуже гостра якщо терапевтичному застосуванні інтерферонів, необхідному на лікування злоякісних пухлин. Інтерферони надають лікувальний вплив на організм рак грудях, шкіри, гортані, легких, мозку, розсіяною миеломе і саркоме Капоци — два останніх захворювання притаманні осіб, котрі страждають набутими імунодефіцитами (див. нижче). Інтерферони корисні й під час лікування розсіяного склерозу. Методи генетичної інженерії дають змогу одержувати модифіковані Інтерферони. Антивірусна активність інтерферонів варіює при амінокислотних заміни (J. Werenne, 1983). Американська компанія Cetus Corporation виробляє?-интер-ферон, в амінокислотною послідовності якого цистеин вагітною 17 заміщений на серії. Це спричиняє підвищенню терапевтичної активності препарату, оскільки запобігає бачимо in vitro формування неактивного димера?-интер-ферона з допомогою дисульфидных перетинів поміж залишками цистеина вагітною 17. Певні надії покладає модифікацію інтерферонів шляхом отримання гібридних молекул (Є. Д. Свердлов, 1984). Интерлейкины—сравнительно короткі (близько 150 амінокислотних залишків) поліпептиди, що у організації імунної системи.

Моноклокальные антитіла і ДНК-или РНК-пробы.

Моноклональные антитіла — продукти В-гибридомных клітин — використовують із діагностики різноманітних захворювань. Маючи високої специфічністю дії, вони забезпечують ідентифікацію як виду збудника, але його серотипа. З допомогою моноклональних антитіл можна тестувати різні гормони, метаболіти, білкові чинники. Найбільш швидкий метод індикації грунтується на застосуванні антитіл, іммобілізованих на мембранних електродах — аналоги ферментних біосенсорів. Вони дозволяють діагностувати вагітність, виявляти схильність до діабету, ревматоидному артриту (J. Col-lins et al., 1986), ідентифікувати спадкові захворювання, що супроводжуються втратою тих чи інших ферментів та інших білкових компонентів. Моноклональні антитіла широко використовують із діагностики раку та визначенням його форм. Труднощі пов'язані про те, що специфічних «ракових» антигенів, по- видимому, немає, і характерні для злокачественно переродившейся клітини детермінанти може бути із певною, нехай невеличкий, ймовірністю виявлено й у здорових клітинах. Перспективна діагностика раку з допомогою моноклональ-ных антитіл до вироблюваним на злоякісну пухлину особливим гормонів, аутокринам, провідним до самостимуляції зростання ракових клітин. Моноклональні антитіла мають як діагностичне, а й лікувальне значення.

Рекомбинантные вакцини і вакцины-антигены.

Вакцинация — одна з основних способів боротьби з інфекційними захворюваннями. Шляхом поголовної вакцинації ліквідована віспа, різко обмежена поширення сказу, поліомієліту, жовтої лихоманки. На порядку денному — виготовлення вакцин проти грипу, гепатитів, герпесов, свинки, кору, гострих респіраторних захворювань. Велике економічне значення має тут розробка вакцин проти хвороб сільськогосподарських тварин — ящуру, африканської хвороби коней, овечої бо- лезни «синього мови», трипаносомозов та інших. Традиційні вакцинные препарати виготовляють з урахуванням ослаблених, инактивиро-ванных чи дезінтегрованих збудників хвороб. Сучасні біотехнологічні розробки передбачають створення рекомбінантних вакцин і вакцин-антигенов. Вакцини обох типів засновані на генноинженерном підході. Для отримання рекомбінантних вакцин зазвичай використовують добре відомий вірус коров'ячої віспи (осповакцины). У його ДНК убудовують чужорідні гени, які кодують імуногенні білки різних збудників (гемагглютинин вірусу грипу, гликопротеин D вірусу герпесу, поверховий антиген вірусу гепатиту У, антиген малярійного плазмодия). Виходять вакцини проти відповідних інфекцій, добре зарекомендували себе у дослідах на тварин. До їх гідностям є можливість створення поливалентных вакцинних препаратів з урахуванням об'єднання ділянок ДНК різних патогенів «під егідою» ДНК вірусу осповакцины. Відкривається можливість одномоментної комплексної імунізації, скажімо, великої рогатої худоби проти всіх небезпечних інфекцій даної місцевості. Вакцины-антигены отримують, клонируя гени збудника хвороби і Є. colt, дріжджах, клітинах комах і ссавців. Клонирован ген поверхового антигену HBS-вируса гепатиту У (сироваткового гепатиту), ген білка оболонки УРЬвируса ящуру. Вірус ящуру існує у вигляді багатьох серотипів, методом білкової інженерії вдалося скомбінувати імуногенні компоненти різних серотипів у межах однієї вакцины-антигена. Вакцины-антигены высокостабильны при зберіганні і перевезенні, порівняно прості їх виготовляти (зокрема і за великомасштабному виробництві), містять мінімум білка і тому малоопасны як алергени. Вони гарантовані від залишкової інфекційності — здібності викликати інфекційну хвороба натомість, щоб предохранять від нього. Проблемою є низька імуногенність вакцин-антигенов. Однією з причин їхнього то, можливо те, що вакцина не включає всіх компонентів збудника, необхідні створення імунітету щодо нього. Так, вірус, залишаючи клітину, часто «вдягається» її мембраною. Компоненти цієї мембрани, відсутні в генноинженерном білці, може бути иммуноген-ными властивостями. До підвищення імуногенності вакцин-антигенов веде додавання адьювантов, іммобілізація вакцин на носіях чи його включення до липосомы.

Ферменти медичного назначения.

Многообразно застосування ферментних препаратів до медицини. Їх використовують із розчинення тромбів, лікування спадкових захворювань (замість відсутніх ендогенних ферментів), видалення не- життєздатних, денатурированных структур, клітинних і тканинних фрагментів, звільнення організму від токсичних речовин (М. Ф. Казанська та інших., 1984). Яскравий пример-спасение життя хворих на тромбозом кінцівок, легких, коронарних судин серця з допомогою громболитически.х ферментів (стрсптокиназы, урокиназы). У такі препарати створені у иммобилизованной формі під керівництвом Є. І. Чазова і І. У. Березина. Ген урокнназы клонирован в бактерії (P.S. Prentis, 1984). У сучасної медицині протеази застосовуються очищення осередків гнойно- некротических процесів від патологічних продуктів, і навіть на лікування опіків Лікування раку пов'язані з використанням L-аспарагиназы, кото раю позбавляє ракових клітин ресурсів який буде необхідний їх раз вітія аспарагина, яке надходить із струмом крові. Здорові клітини на відміну ракових (деяких типів) здатні до самостійного синтезу аспарагина. Відомо близько 200 спадкових захворювань, обуслов ленних дефіцитом будь-якого ферменту чи іншого білкового чинника. Нині роблять спроби лікування цих захворювань із застосуванням ферментів. Так, намагаються лікувати хвороба Готі, коли він організм неспроможний розщеплювати, глюкоцереброзиды (P.S. Prentis, 1984). Останніми роками дедалі більше уваги приділяють ингибиторам ферментів. Інгібітори протеаз, отримані з актино мицетов (лейпептин, антипаин, химостатин та інших.) і генноинже нерных штамів Є. coil (эглин) і дріжджів (?-1 антитрипсин) корисні при септичних процесах, інфаркті міокарда, емфіземі легких, панкреатиті. Зменшення концентрації глюкози у крові діабетиків можна досягнути при исполь зовании інгібіторів кишкових инвертаз і амилаз, відповідальних за перетворення крохмалю і сахарози в глюкозу. Особливою завданням є пошук інгібіторів ферментів, з допомогою яких патогенні мікроорганізми руйнують антибіотики, запроваджувані у організм хворого. Такі основних напрямів біотехнологічних розробок у галузі медицини. Без перебільшення можна сказати що центральне додаток новітніх біотехнологічних підходів — медицина. Однією проблеми, що з білками медичного призначення, служить наявність вони побічні ефекти. Наприклад, алергічні реакції виникають і проти генноинженерных білків, і проти моноклональних антитіл, навіть якщо їх отримують з урахуванням людських гібридом. Проблема не нова для медицини не є непреодолимой.

Генна терапія – сукупність генно-інженерних (біотехнологічних) та медичних методів, що направлені на внесення змін у генетичний апарат соматичних, статевих або ембріональних клітин людини з метою лікування спадкових та набутих захворювань. “Ремонт генів” має фундаментальну перевагу в порівнянні з іншими методами лікування, оскільки дає можливість корегувати дефекти на первинному молекулярному рівні. Йдеться про генну терапію соматичних клітин, оскільки робота з статевими клітинами та клітинами плода заборонена як з етичних міркувань, так і законодавчо.

Генна терапія соматичних клітин людини – корекція специфічного спадкового захворювання шляхом введення в дефектну соматичну клітину-мішень функціонального гена, здатного до експресії. Перспективи генної корекції соматичних клітин стали реальними у 80-х роках минулого сторіччя. На той час були розроблені методи отримання ізольованих генів, створені еукаріотичні експресуючі вектори, стали рутинними експерименти з переносу генів на мишах та інших піддослідних тваринах. Після того як були встановлені молекулярні основи трансформації бактерій (перенесення генів з одного штаму в інший), з’явилась надія, що аналогічний механізм – введення нормальних генів в дефектні соматичні клітини – можна буде використати для лікування спадкових захворювань людини.

Неконтрольоване зниження чи підвищення концентрації будь якого ензиму в клітинах (тканинах) викликає порушення протікання відповідної ензиматичної реакції, є біохімічною основою розвитку патологічного процесу і для його лікування застосовують один з наступних видів генної терапії.

Замісна терапія –використовується для лікування генетичних дефектів, обумовлених втратою функції гена. Суть полягає у введенні у клітини копії нормального “терапевтичного” гена та створення умов його замісної експресії, щоб замінити функцію дефектного гена.

Інгібіторна терапія лікування генетичних захворювань, обумовлених надмірною активацією гена. Стратегія скерована на вбудовування гена, продукт якого блокує експресію патологічного гена і тим самим гальмує розвиток хвороби.

Елімінація певних клітин знищення конкретної популяції клітин, зокрема трансформованих. Стратегія може включати: утворення в клітині токсичного продукту; експресію ензиму, що перетворює нетоксичний лікарський препарат в токсичний продукт; специфічне мічення клітин для їх елімінації імунною системою. Значні успіхи досягнуті в посиленні експресії цитохрому Р-450 в трансформованих (ракових) клітинах. Перетворення нетоксичних сполук за дії цього ензиму на високотоксичні вбиває саме ракові клітини.

Застосування підходів генної терапії з метою введення у клітини-мішені функціонального гена вимагає вирішення ряду проблем, зокрема як отримати доступ до клітин, що повинні піддаватись корекції; як здійснити доставку терапевтичного гена; яка доля клітин-мішеней повинна отримати ген, щоб загальмувати розвиток хвороби; чи контроль транскрипції гена є достатнім для забезпечення ефективності його функціонування; чи не викличе надлишкова експресія введеного гена побічних ефектів; чи будуть модифіковані клітини функціонувати (підтримуватись) безмежно довгий час, чи необхідно буде проводити повторні введення? На ряд поставлених запитань, які стосуються певних спадкових захворювань, вже отримано відповіді.

Підходи, що застосовуються в генній терапії можна розділити на дві суттєво відмінні категорії, відомі як генна терапія ex vivo та генна терапія in vivo.

Генна терапія ex vivo, тобто зовнішня, включення “терапевтичного” гена в геном клітин здійснюється поза організмом. Клітини крові, кісткового мозку або інших тканин отримують від пацієнта, трансформують (вбудовують необхідний “терапевтичний” ген) поза організмом, здійснюють відбір та нарощування “виправлених” клітин і потім повертають модифіковані клітини в організм пацієнту шляхом інфузії або трансплантації. Використання власних (аутологічних) клітин пацієнта гарантує, що після інфузії чи трансплантації у нього не буде розвиватись імунна відповідь.

Особливо перспективним напрямом у генній терапії ex vivo виявилась генно-інженерна модифікація поліпотентних стовбурових клітин кісткового мозку з їх наступною інфузією або трансплантацією пацієнту. Терапевтичний ефект трансплантації кісткового мозку пов’язаний з наявністю в ньому ембріональних стовбурових клітин, які здатні проліферувати і диференціюватись в різні типи клітин крові, зокрема такі як В- та Т-лімфоцити (В- та Т-клітини), макрофаги, еритроцити, тромбоцити та остеобласти. Наприклад, у випадку якщо генна мутація порушує функції макрофагів, трансплантація кісткового мозку забезпечує реципієнту постійний запас компетентних макрофагів, які утворюються з поліпотентних стовбурових клітин.

Значних успіхів було досягнуто у лікуванні генетичного дефекту ензиму аденозиндезамінази (АДА), який викликає порушення метаболізму пуринів та призводить до підвищення в крові рівня аденозину та дезокси-аденозину. Їх токсична дія веде до загибелі В- та Т-лімфоцитів та розвитку важкого комбінованого імунодефіциту (SCID – severe combined immunodeficiency). Оскільки В- та Т-лімфоцити утворюються зі стовбурових клітин, то перенесення в стовбурові клітини“нормального” гена АДА з наступним введенням їх пацієнту, сприяє зниженню в його крові рівня аденозину та дезоксиаденозину, що попереджує руйнування В- та Т-лімфоцитів

В 1990 р. було здійснено перше успішне застосування генної терапії для лікування SCID у двох дівчаток. Ця робота продемонструвала безпечність генної терапії ex vivo з використанням стовбурових клітин кісткового мозку. В теперішній час для лікування SCID у новонароджених переважно використовують стовбурові клітини пуповинної (кордової) крові. З пуповинної крові отримують стовбурові (CD34) клітини, трансдукують в них кДНК ензиму АДА і такі генетично модифіковані клітини вводять новонародженим з дефіцитом АДА та симптомами SCID. Показана висока ефективність такого лікування саме у новонароджених.

Прикладом успішної генної терапії ex vivo з використанням аутологічних клітин, є випадок з пацієнткою гомозиготною по рецесивному гену сімейної гіперхолестеринемії. Її гепатоцити були позбавлені рецепторів ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ), не поглинали ЛПНЩ та не вивільняли холестерол для потреб клітин. Постійна циркуляція в крові великої кількості холестеролу викликала закупорку артерій та важку хворобу серця. Застосовувані лікарські засоби були неефективними, а шунтування коронарних артерій давало короткочасний ефект. У пацієнтки відібрали біля 15% печінки, гепатоцити помістили в культуральне середовище і ввели в них ДНК рекомбінантного ретровірусу, що містив кДНК протеїну ЛПНЩ- рецептора. Затим здійснили інфузію трансдукованих гепатоцитів в печінку пацієнтки, де вони прижились, експресували кДНК ЛПНЩ- рецептора та виробляли функціонально активний протеїн-рецептор, як мінімум 20 місяців. Стан пацієнтки за показниками вмісту ліпідів значно покращився. Важливо, що в її організмі не утворювались антитіла до протеїнів ЛПНЩ- рецепторів.

Генна терапія in vivo передбачає доставку “терапевтичного” гена безпосередньо в клітини певної тканини пацієнта. З цією метою клонується“терапевтичний” ген, що кодує синтез протеїну, який корегує генетичний дефект. Клонований ген доставляється до клітин певної тканини пацієнта зі спадковим захворюванням і в них експресується. Оскільки генетична конструкція вводиться в організм і досягає всіх клітин, важливо щоб промотор p, під контролем якого здійснюється транскрипція, мав високу тканинну специфічність і забезпечував експресію ”терапевтичного” гена лише в певній тканині.

Надзвичайно важливою проблемою генної терапії є вибір способу доставки терапевтичного гена до тканини-мішені. Ідеальна система доставки “терапевтичного” гена повинна забезпечувати: високу ефективність цільового поглинання “терапевтичного” гена клітинами-мішенями; мінімальне його внутрішньоклітинне руйнування під час транспорту в ядро; високий рівень експресії, який забезпечить лікувальний ефект; відсутність перебудов і мутацій; відсутність імуногенності продукту експресії.

Вірусні системи доставки „терапевтичних” генів. Серед способів введення генних конструкцій в організм лідирують вірусні вектори, які швидко поширюються в організмі та проникають у клітини подібно до своїх вірусів-пращурів. Найбільш ефективними для цілеспрямованої доставки “терапевтичного” гена в геном клітини-мішені та його експресії виявились вектори, створені на основі мишачих ретровірусів. Була розроблена процедура створення ретровірусного вектора. Для отримання векторапроводять наступні операції: повнорозмірну ДНК ретровіруса вбудовують в плазміду; за допомогою ендонуклеазного розщеплення видаляють більшу частину гена gag і гени pol та env, залишаючи 5'- кінцевий залишок гена gag та 5'- і 3'- LTR; поряд з ψ+- ділянкою вбудовують “терапевтичний” ген, транскрипція якого буде контролюватись 5'-LTR - промотором; вбудовують і маркерний селективний ген з власним промотором. Отримана конструкція включає терапевтичний та маркерний гени і дозволяє експресувати обидва клоновані гени. Максимальний розмір ДНК-вставки, яку може переносити ретровірусний вектор, складає 8 т.п.н. Однак ефективність її доставки в ядро і подальшої інтеграції в геном клітини-господаря є дуже низькою.

В подальшому була розроблена методика упаковки повнорозмірної РНК вірусного вектора в інтактні вірусні частки за допомогою „пакувальної” та „продукуючої” клітинних ліній. Така упаковка забезпечує високу ефективність проникнення вірусних часток в клітину та гарантує вбудовування відповідної до неї ДНК в геном клітини-господаря. Для цього методами генної інженерії була створена “пакувальна” клітинна лінія, яка містила в одній з ділянок геному Δψ+-сегмент 5'-LTR- gag- 3'-LTR (тобто сегмент, позбавлений повної функціональної ψ+-послідовності), а в іншій ділянці – Δψ+-сегмент 5'-LTR- pol-env- 3'-LTR. Обидва ці сегменти здатні транскрибуватись, однак із-за відсутності повної ψ+-послідовності утворюються молекули вірусної РНК меншого ніж в нормі розміру, а тому формуються пусті вірусні частки. При трансфекції ДНК ретровірусного вектора в такі клітини, ДНК ретровіруса встроюється в хромосомну ДНК клітин і транскрибується з утворенням повнорозмірної РНК ретровіруса, що містить ψ+-послідовність. За таких умов у вірусні капсиди упаковується лише РНК вектора. Утворені інтактні вірусні частки можна використовувати для високоефективної доставки ретровірусного вектора в клітини-мішені. В “пакувальній” клітинній лінії нуклеотидні послідовності ретровіруса та вектора локалізовані в трьох різних ділянках хромосоми, а тому мало вірогідною є така послідовність рекомбінацій, яка приведе до утворення компетентного по реплікації ретровіруса.

Ретровіруси активно інфікують клітини, що реплікуються. Для перенесення генів в клітини-мішені, що інтенсивно ростуть, їх обробляють очищеними частками упакованого ретровірусного вектора, або ж проводять їх спільне культивування з клітинною лінією, яка продукує вектор. Далі здійснюють вибіркову селекцію для розділення клітин-мішеней та “пакувальних” клітин. Після тестування трансдуковані клітини нарощують у великих кількостях та з різними інтервалами вводять пацієнту. Суттєвим недоліком застосування ретровірусів є їх здатність викликати злоякісну трансформацію клітин. Необхідно зменшити або повністю виключити таку можливість.

Для створення векторів використовуються різні віруси, зокрема у 27% випадків використовуються ретровіруси, у 26% – аденовіруси, у 15% – гола плазмідна ДНК, у 16% – аденоасоційовані віруси, у 10% – вірус простого герпесу, у 4% – лентивіруси, вірус папіломи, гібридні вірусні конструкції, в тому числі на базі вірусу простого герпесу й аденоасоційованого вірусу, тощо. Проблемою в генній терапії in vivo є також те, що ретровірусні вектори проникають лише в клітини-мішені які діляться, тоді як в багатьох тканинах на які спрямована генна терапія, більшість клітин не діляться. Тому були розроблені різні вірусні та невірусні векторні системи доставки “терапевтичних” генів, виходячи з широкого спектру потенційних тканин-мішеней (шкіра, м’язи, мозок, товста кишка, селезінка, печінка, клітини крові, тощо) та розподілу їх в організмі людини.

 


Дата добавления: 2015-10-16; просмотров: 507 | Нарушение авторских прав


<== предыдущая страница | следующая страница ==>
Приложение Б| ROAD-MOVIE CLUB

mybiblioteka.su - 2015-2024 год. (0.014 сек.)